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豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測檢測

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發(fā)布時間：2025-07-25 08:49:03 更新時間：2025-07-24 22:14:51

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測中心

豬瘟病毒實時熒光RT-PCR檢測概述

豬瘟（Classical Swine Fever, CSF）是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種高度接觸性、致死性傳染病，對全球生豬養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅。該病毒可通過直接接觸、污染物或垂直傳播擴散，感染后表現(xiàn)為高熱、出血性病變及高死亡率，具有極強的經(jīng)濟破壞性。傳統(tǒng)診斷方法如病毒分離、血清學(xué)檢測等存在耗時長、靈敏度低等局限，而實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time RT-PCR）憑借其快速、高靈敏度、特異性強等優(yōu)勢，成為當(dāng)前CSFV檢測的核心技術(shù)。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)病毒核酸的精準(zhǔn)定量，適用于疫情監(jiān)測、疫苗效果評估及早期預(yù)警，為豬瘟防控提供科學(xué)支撐。

檢測項目

實時熒光RT-PCR檢測的核心目標(biāo)包括：
1. 病原體檢測：直接檢測臨床樣本（如血液、脾臟、淋巴結(jié)）中的CSFV特異性核酸片段，確認(rèn)感染狀態(tài)。
2. 病毒分型：通過靶向病毒基因組的保守區(qū)域（如5'UTR、E2基因），區(qū)分野毒株與疫苗株（如C株疫苗），為流行病學(xué)溯源提供依據(jù)。
該檢測項目適用于生豬養(yǎng)殖場、屠宰場、出入境檢疫及實驗室研究等多個場景。

檢測儀器

完成檢測需配套以下關(guān)鍵儀器：
- 實時熒光PCR儀（如ABI 7500、Bio-Rad CFX96）：用于核酸擴增與熒光信號實時監(jiān)測。
- 核酸提取儀（如Qiagen QIAcube）：自動化提取病毒RNA，提高檢測效率。
- 高速離心機：用于樣本預(yù)處理及試劑離心混勻。
- 超凈工作臺：保障核酸提取與擴增體系配置的無污染環(huán)境。
- 微量移液器及配套耗材：確保試劑分裝的精準(zhǔn)性。
- 生物安全柜：高風(fēng)險樣本操作時的生物安全防護。

檢測方法

檢測流程分為以下關(guān)鍵步驟：
1. 樣本采集與處理：采集病豬全血、脾臟或扁桃體等組織，勻漿后離心取上清液。
2. 病毒RNA提取：使用商業(yè)化RNA提取試劑盒（如TRIzol法或磁珠法），DNase處理去除基因組DNA干擾。
3. 引物與探針設(shè)計：針對CSFV基因組保守區(qū)設(shè)計特異性引物及TaqMan探針（如FAM標(biāo)記探針，淬滅基團為BHQ1）。
4. RT-PCR反應(yīng)體系配置：采用一步法試劑盒，包含反轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs及緩沖液，反應(yīng)體積通常為25μL。
5. 擴增程序設(shè)置：50℃反轉(zhuǎn)錄15分鐘，95℃預(yù)變性10分鐘，隨后進行40個循環(huán)的95℃ 15秒、60℃ 1分鐘。
6. 結(jié)果分析：通過熒光閾值（Threshold）判定Ct值，Ct≤35為陽性，35＜Ct＜40需復(fù)檢，陰性對照無擴增曲線。

檢測標(biāo)準(zhǔn)

檢測過程需嚴(yán)格遵循以下標(biāo)準(zhǔn)：
- 國際標(biāo)準(zhǔn)：世界動物衛(wèi)生組織（OIE）《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》中CSFV分子檢測指南。
- 國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 36872-2018《豬瘟病毒熒光RT-PCR檢測方法》。
- 行業(yè)規(guī)范：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《豬瘟防治技術(shù)規(guī)范》中實驗室檢測要求。
- 質(zhì)量控制：每批次檢測需包含陽性對照（CSFV標(biāo)準(zhǔn)品）、陰性對照（無核酸水）及內(nèi)標(biāo)（如β-actin），確保檢測體系可靠性。

結(jié)語

實時熒光RT-PCR技術(shù)通過精準(zhǔn)的核酸擴增與實時監(jiān)測機制，極大提升了豬瘟病毒檢測的時效性與準(zhǔn)確性，成為疫情防控的關(guān)鍵工具。檢測過程中需嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作程序（SOP），結(jié)合儀器校準(zhǔn)、環(huán)境控制和人員培訓(xùn)，確保結(jié)果的可重復(fù)性與國際可比性。未來，隨著數(shù)字PCR等新技術(shù)的應(yīng)用，CSFV檢測將向更高靈敏度與絕對定量方向發(fā)展，為豬瘟凈化提供更強技術(shù)保障。