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魚真鯛虹彩病毒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-05-14 06:27:39 更新時(shí)間：2025-05-13 06:27:39

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

魚真鯛虹彩病毒聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)的重要性

真鯛虹彩病毒（Red Sea Bream Iridovirus, RSIV）是一種嚴(yán)重危害海水魚類養(yǎng)殖業(yè)的病原體，尤其對(duì)真鯛、石斑魚等高經(jīng)濟(jì)價(jià)值魚類的幼魚和成魚具有高致病性。該病毒可通過水體、接觸或垂直傳播，感染后表現(xiàn)為體表出血、內(nèi)臟器官壞死及高死亡率。由于病毒的潛伏期長(zhǎng)且早期癥狀不典型，傳統(tǒng)診斷方法（如病理學(xué)觀察）存在靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)等問題。因此，基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）的分子檢測(cè)技術(shù)成為快速、準(zhǔn)確診斷RSIV感染的核心手段，對(duì)疾病防控和養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

檢測(cè)項(xiàng)目與內(nèi)容

RSIV的PCR檢測(cè)主要針對(duì)病毒的特異性基因序列，檢測(cè)項(xiàng)目包括： 1. 病毒核酸提?。簭聂~類的血液、鰓、肝臟或脾臟組織中分離病毒DNA。 2. 靶基因擴(kuò)增：針對(duì)RSIV的ATP酶基因（ATPase）或主要衣殼蛋白（MCP）基因設(shè)計(jì)特異性引物。 3. 感染階段判定：通過循環(huán)閾值（Ct值）或電泳條帶亮度評(píng)估病毒載量，判斷感染程度。 4. 樣本類型擴(kuò)展：支持對(duì)水體、飼料等環(huán)境樣本的病毒污染檢測(cè)。

檢測(cè)儀器與設(shè)備

完成RSIV的PCR檢測(cè)需依賴以下核心儀器： 1. PCR擴(kuò)增儀：用于DNA模板的擴(kuò)增，推薦使用具有梯度溫控功能的全自動(dòng)設(shè)備（如Bio-Rad T100）。 2. 核酸提取儀：高效提取病毒DNA（如Qiagen QIAcube）。 3. 電泳系統(tǒng)：用于PCR產(chǎn)物分析，包括凝膠成像儀和電泳槽。 4. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（qPCR）：若采用熒光探針法，需配備如ABI 7500等設(shè)備。

檢測(cè)方法與步驟

RSIV的PCR檢測(cè)流程分為以下關(guān)鍵步驟： 1. 樣本采集與預(yù)處理：無菌采集魚體組織，勻漿后離心取上清液。 2. 病毒DNA提取：使用商業(yè)化試劑盒（如DNeasy Blood & Tissue Kit）純化DNA。 3. 引物設(shè)計(jì)與驗(yàn)證：依據(jù)GenBank中RSIV的保守序列設(shè)計(jì)引物（如ATPase-F: 5'-GACTTGGCCACCTTCATG-3'；ATPase-R: 5'-GTCTCTGGAGAAGGTGTTG-3'）。 4. PCR擴(kuò)增：反應(yīng)體系包含Taq酶、dNTPs和模板DNA，循環(huán)條件為95℃預(yù)變性5分鐘，隨后35個(gè)循環(huán)（94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 45秒），最終72℃延伸7分鐘。 5. 結(jié)果分析：通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察約500 bp的特異性條帶，或通過qPCR的Ct值判定陽性。

檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制

RSIV的PCR檢測(cè)需遵循以下標(biāo)準(zhǔn)以確保準(zhǔn)確性： 1. 國際標(biāo)準(zhǔn)：參照世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）《水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)》的分子檢測(cè)指南。 2. 國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《GB/T 36193-2018 魚類虹彩病毒檢測(cè)方法》進(jìn)行操作規(guī)范。 3. 陽性對(duì)照：每次檢測(cè)需加入已知RSIV陽性DNA作為擴(kuò)增對(duì)照。 4. 防污染措施：實(shí)驗(yàn)分區(qū)（試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)、擴(kuò)增區(qū)），并使用UNG酶防交叉污染。 5. 靈敏度驗(yàn)證：檢測(cè)限應(yīng)達(dá)到10² copies/μL以下。

通過上述標(biāo)準(zhǔn)化流程，RSIV的PCR檢測(cè)可在6小時(shí)內(nèi)完成，為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的疫情預(yù)警和精準(zhǔn)防控提供可靠技術(shù)支持。