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流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-06 15:31:16 更新時(shí)間：2025-05-13 17:38:11

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

一、技術(shù)原理與核心應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry） 是一種通過(guò)激光激發(fā)細(xì)胞標(biāo)記的熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)分析單細(xì)胞的 物理特性（大小、顆粒度）和 生化特性（表面/胞內(nèi)標(biāo)記物、DNA含量）的高通量檢測(cè)技術(shù)，廣泛應(yīng)用于 免疫分型、細(xì)胞周期分析、凋亡檢測(cè)、細(xì)胞活性測(cè)定 及 稀有細(xì)胞分選。

核心優(yōu)勢(shì)：

單細(xì)胞分辨率：每秒可分析數(shù)萬(wàn)個(gè)細(xì)胞；
多參數(shù)同步檢測(cè)：支持多色熒光標(biāo)記（最高達(dá)30色以上）；
功能分選結(jié)合：通過(guò)流式分選（FACS）分離目標(biāo)細(xì)胞亞群。

二、檢測(cè)流程與操作規(guī)范

1. 樣本制備

樣本類(lèi)型	制備方法	關(guān)鍵注意事項(xiàng)
外周血/骨髓	紅細(xì)胞裂解（ACK裂解液）→洗滌→抗體染色（避光，4℃×30min）	避免過(guò)度裂解導(dǎo)致白細(xì)胞損傷
貼壁細(xì)胞	胰酶消化→終止→離心（300g×5min）→重懸→抗體染色	控制消化時(shí)間，防止細(xì)胞團(tuán)塊形成
組織樣本	機(jī)械破碎/酶消化（膠原酶IV）→過(guò)濾（70μm濾網(wǎng)）→密度梯度離心（Percoll/Ficoll）	去除碎片，保證單細(xì)胞懸液（活率≥80%）

2. 抗體標(biāo)記與熒光選擇

抗體選擇：
- 驗(yàn)證抗體特異性（同型對(duì)照、Fc阻斷劑）；
- 優(yōu)化抗體濃度（預(yù)實(shí)驗(yàn)梯度稀釋?zhuān)苊膺^(guò)量導(dǎo)致非特異性結(jié)合）。
熒光染料搭配：
- 遵循光譜重疊最小化原則（如FITC與PE避免共用）；
- 高表達(dá)抗原搭配弱熒光染料（如PE-Cy7），低表達(dá)抗原搭配強(qiáng)熒光染料（如APC）。

3. 儀器操作與參數(shù)設(shè)置

步驟	操作要點(diǎn)	儀器參數(shù)示例
液流校準(zhǔn)	使用標(biāo)準(zhǔn)微球（如BD CS&T）校準(zhǔn)液流穩(wěn)定性與光路對(duì)焦	流速：低（≤12μL/min，高精度）；高（≥60μL/min，高通量）
閾值設(shè)定	根據(jù)FSC/SSC排除碎片，設(shè)置閾值（如FSC-H≥5,000）	觸發(fā)通道：FSC或熒光通道（如DAPI）
補(bǔ)償調(diào)節(jié)	單染對(duì)照樣本計(jì)算熒光溢漏矩陣（補(bǔ)償矩陣）	使用CompBeads或單染樣本，調(diào)節(jié)補(bǔ)償至陰性群與陽(yáng)性群分離

4. 數(shù)據(jù)分析與可視化

軟件工具：FlowJo、BD FACSDiva、Kaluza、CytoBank。
關(guān)鍵分析步驟：
1. 設(shè)門(mén)（Gating）：
  - 前向散射（FSC） vs 側(cè)向散射（SSC）排除碎片和死細(xì)胞；
  - 單參數(shù)直方圖或多參數(shù)點(diǎn)圖圈定目標(biāo)細(xì)胞群（如CD3+CD4+ T細(xì)胞）。
2. 統(tǒng)計(jì)與可視化：
  - 計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分比、平均熒光強(qiáng)度（MFI）；
  - 熱圖或t-SNE降維展示多色數(shù)據(jù)聚類(lèi)。

三、常見(jiàn)問(wèn)題與解決方案

問(wèn)題現(xiàn)象	可能原因	解決方案
高背景信號(hào)	非特異性結(jié)合或死細(xì)胞干擾	加入Fc阻斷劑（如Human TruStain FcX），使用死活染料（如DAPI、PI）排除死細(xì)胞
細(xì)胞結(jié)團(tuán)	消化不充分或離心速度不當(dāng)	增加消化時(shí)間（37℃×10min），過(guò)濾前輕柔吹打，離心速度降至200g×5min
熒光信號(hào)弱	抗體濃度不足或激光功率低	提高抗體濃度（預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化），檢查激光器功率與PMT電壓設(shè)置
補(bǔ)償不足/過(guò)度	單染對(duì)照不純或補(bǔ)償矩陣錯(cuò)誤	使用單染微球（CompBeads），手動(dòng)調(diào)整補(bǔ)償至陰性群居中
分選效率低	液流不穩(wěn)定或噴嘴堵塞	清潔噴嘴（70%乙醇沖洗），校準(zhǔn)液滴延遲，使用高純度鞘液（0.22μm過(guò)濾）

四、設(shè)備與試劑推薦

1. 核心設(shè)備

設(shè)備類(lèi)型	功能與特點(diǎn)	推薦型號(hào)
分析型流式細(xì)胞儀	多激光配置（如488nm、640nm、405nm）	BD LSRFortessa、Beckman CytoFLEX
流式分選儀	高速分選（≥70,000細(xì)胞/秒），四向分選純度≥99%	BD FACSAria III、Sony SH800
全自動(dòng)樣本制備系統(tǒng)	支持96孔板自動(dòng)染色與洗滌	Intellicyt iQue Screener

2. 常用試劑

試劑類(lèi)型	應(yīng)用場(chǎng)景	推薦產(chǎn)品
熒光抗體	表面/胞內(nèi)標(biāo)記	BioLegend、BD Biosciences
死活染料	區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞	Thermo Fisher LIVE/DEAD™
補(bǔ)償微球	多色補(bǔ)償校準(zhǔn)	BD CompBeads、UltraComp eBeads