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Ames試驗（細菌回復突變試驗）

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發(fā)布時間：2025-03-13 11:13:03 更新時間：2025-05-13 17:40:37

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作者：中科光析科學技術(shù)研究所檢測中心

Ames試驗（細菌回復突變試驗）是評估化合物致突變性的金標準，廣泛應用于 藥物、化學品、食品添加劑及化妝品 的遺傳毒性篩選。以下是基于 OECD 471指南、ICH S2(R1) 及 FDA遺傳毒性測試指南 的系統(tǒng)化檢測方案：

一、試驗原理與菌株選擇

菌株	突變類型	檢測靶點	推薦用途
TA98	移碼突變	hisD3052（組氨酸合成缺陷）	檢測平面型化合物（如多環(huán)芳烴）
TA100	堿基置換	hisG46（G→T置換）	檢測烷化劑、亞硝胺類
TA1535	堿基置換	hisG46（無uvrB修復系統(tǒng)）	高特異性檢測點突變
TA102	氧化損傷	hisG428（攜帶pKM101質(zhì)粒）	檢測活性氧（ROS）誘導劑

代謝活化系統(tǒng)：

S9 Mix：大鼠肝微粒體（Aroclor 1254誘導），模擬哺乳動物代謝（終濃度5%~10%）。

二、標準化操作流程

1. 試驗設計

劑量設置：
1. 預試驗確定最高劑量（≤5mg/皿或10mM，無抑菌性）；
2. 正式試驗設5~8個劑量梯度（包括陰性對照和陽性對照）。
陽性對照：
- 無代謝活化：NaN?（TA100）、4-NQO（TA98）；
- 有代謝活化：2-AA（TA98）、DMN（TA100）。

2. 試驗步驟

頂層瓊脂制備：
- 0.5mM組氨酸/生物素，45℃保溫；
- 混合菌液（10? CFU/mL）、待測物、S9 Mix（如適用）。
鋪板與培養(yǎng)：
- 傾注于最低葡萄糖瓊脂平板，37℃孵育48~72小時；
- 每劑量3個平行皿，重復試驗（不同日期）。

3. 數(shù)據(jù)采集

菌落計數(shù)：
- 回復突變菌落數(shù) ≥ 2倍陰性對照（且劑量-反應關(guān)系顯著）判為陽性；
- 背景菌落數(shù)（陰性對照）：TA98（20~~50）、TA100（100~~200）。

三、結(jié)果判定與統(tǒng)計方法

判定標準	要求	統(tǒng)計方法
陽性結(jié)果	任一菌株突變率≥2倍對照，且劑量-反應顯著	線性回歸分析（p<0.05）
陰性結(jié)果	所有菌株突變率<2倍對照，無劑量相關(guān)性	方差分析（ANOVA）
可疑結(jié)果	突變率介于1.5~2倍，需重復驗證	非參數(shù)檢驗（如Mann-Whitney U）

四、試驗優(yōu)化與驗證

關(guān)鍵參數(shù)	優(yōu)化策略	驗證標準
菌株活力	定期凍存復蘇（-80℃），檢測自發(fā)回復突變率	自發(fā)突變率符合歷史數(shù)據(jù)范圍
S9活性	檢測CYP1A2活性（乙氧基試鹵靈脫乙基試驗）	酶活性≥5nmol/min/mg蛋白
抑菌性評估	背景菌落數(shù)下降≥50%時，判定劑量過高	調(diào)整劑量或溶劑體系（如DMSO）

五、常見問題與解決方案

問題現(xiàn)象	可能原因	改進措施
假陽性結(jié)果	化合物與瓊脂成分反應	更換溶劑（如用水替代DMSO），預孵育后離心去除沉淀
背景菌落過多	組氨酸殘留或污染	嚴格滅菌瓊脂，使用新鮮配制培養(yǎng)基
S9活性不足	肝微粒體制備不當或保存失效	更換S9批次，-80℃分裝保存（避免反復凍融）
劑量-反應曲線不顯著	代謝活化不足或測試濃度范圍窄	增加S9比例（至20%），擴展劑量梯度（0.1~5000μg/皿）

六、法規(guī)符合性報告

報告內(nèi)容：
- 受試物信息（CAS號、批次）、菌株來源（如ATCC編號）、試驗條件（劑量、S9比例）；
- 原始數(shù)據(jù)（菌落計數(shù)表）、統(tǒng)計結(jié)果、結(jié)論（致突變性分類）。
國際合規(guī)性：
- FDA：符合GLP規(guī)范（21 CFR Part 58）；
- 歐盟：REACH法規(guī)（EC 1907/2006）附件VII要求；
- ICH：藥物注冊需滿足ICH M7（致突變雜質(zhì)控制）。

通過系統(tǒng)化Ames試驗，可高效識別潛在遺傳毒性風險。建議結(jié)合 體外微核試驗（OECD 487） 或 染色體畸變試驗（OECD 473） 進行綜合評估，并針對難溶化合物采用 預溶解處理（如超聲/加熱）。對于復雜混合物（如中藥提取物），需增加 代謝活化時間（預孵育30min） 以提升檢測靈敏度。