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非洲豬瘟檢測(cè)

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發(fā)布時(shí)間：2025-03-13 14:04:07 更新時(shí)間：2025-05-13 17:40:43

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作者：中科光析科學(xué)技術(shù)研究所檢測(cè)中心

非洲豬瘟（African Swine Fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（ASFV）引起的豬類(lèi)烈性傳染病，具有高致死率（急性型死亡率可達(dá)100%）和快速傳播特點(diǎn)。其檢測(cè)需圍繞 病毒核酸、抗原及抗體 等靶標(biāo)展開(kāi)，結(jié)合 現(xiàn)場(chǎng)快速篩查 與 實(shí)驗(yàn)室確診，確保疫情早發(fā)現(xiàn)、早處置。以下是基于 OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)手冊(cè)》、GB/T 18648-2020（非洲豬瘟診斷技術(shù)）》 及 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部應(yīng)急監(jiān)測(cè)指南 的系統(tǒng)化檢測(cè)方案：

一、核心檢測(cè)技術(shù)與應(yīng)用場(chǎng)景

檢測(cè)靶標(biāo)	檢測(cè)方法	技術(shù)特點(diǎn)	適用階段
病毒核酸	實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）	高靈敏度（Ct≤38）、特異性強(qiáng)，可區(qū)分基因型	早期感染、疑似病例確診
病毒抗原	免疫層析試紙條（抗原檢測(cè)）	快速（15分鐘出結(jié)果）、無(wú)需設(shè)備，適合現(xiàn)場(chǎng)篩查	屠宰場(chǎng)/養(yǎng)殖場(chǎng)初步排查
病毒抗體	ELISA（間接法/阻斷法）	高通量、適合群體抗體監(jiān)測(cè)，感染后7~14天可檢出	康復(fù)豬追溯、流行病學(xué)調(diào)查
全基因組測(cè)序	二代測(cè)序（NGS）	精準(zhǔn)溯源、分析變異位點(diǎn)（如EP402R基因缺失）	疫情溯源、毒株分型研究

二、樣本采集與處理規(guī)范

樣本類(lèi)型	采集部位	保存與運(yùn)輸	檢測(cè)優(yōu)先級(jí)
全血/血清	前腔靜脈采血（EDTA抗凝）	4℃保存（24小時(shí)內(nèi)送檢），-80℃長(zhǎng)期保存	抗體檢測(cè)（ELISA）
脾臟/淋巴結(jié)	病變最明顯部位（暗紅色腫大）	置于50%甘油-PBS中，冰袋運(yùn)輸（避免反復(fù)凍融）	核酸檢測(cè)（qPCR）首選
口鼻拭子	口腔分泌物或鼻腔刮取物	病毒保存液中混勻，4℃保存（72小時(shí)內(nèi)檢測(cè)）	活體豬篩查（抗原試紙條）
環(huán)境樣本	車(chē)輛、飼料、水源、土壤等	拭子擦拭后浸入緩沖液，低溫運(yùn)輸（避免陽(yáng)光直射）	污染源追蹤（qPCR）

三、標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)流程

1. 現(xiàn)場(chǎng)快速篩查（抗原試紙條）

樣本處理：
- 取脾臟/淋巴結(jié)勻漿液（PBS 1:5稀釋?zhuān)?rarr; 離心取上清；
- 口鼻拭子直接浸入裂解液，靜置5分鐘。
檢測(cè)操作：
- 滴加3~4滴上清液至試紙條加樣孔→ 15分鐘內(nèi)判讀結(jié)果；
- 陽(yáng)性：C線+T線均顯色；陰性：僅C線顯色。
注意事項(xiàng)：
- 避免高溫/潮濕環(huán)境操作，假陽(yáng)性率≤5%（需實(shí)驗(yàn)室復(fù)核）。

2. 實(shí)驗(yàn)室確診（qPCR）

核酸提取：
- 采用磁珠法（如QIAamp Viral RNA Kit）提取病毒DNA；
- 陽(yáng)性對(duì)照（ASFV P72基因質(zhì)粒）+陰性對(duì)照（DEPC水）。
qPCR擴(kuò)增：
- 引物探針（OIE推薦）：
  - 正向引物：5'-ATGGCACGGTATCGACAACT-3'
  - 反向引物：5'-CTTTGCTGCTGTTCGAGGA-3'
  - 探針：FAM-CCACGGGAGGAATACCAAC-BHQ1
- 反應(yīng)體系：95℃預(yù)變性2min → 95℃ 15s → 60℃ 1min（45循環(huán)）。
結(jié)果判定：
- 陽(yáng)性：Ct≤38且擴(kuò)增曲線呈S型；可疑：38<Ct≤40，需復(fù)檢；
- 陰性：Ct>40或無(wú)擴(kuò)增。

3. 抗體檢測(cè)（ELISA）

包被抗原：重組ASFV P54/P30蛋白；
操作步驟：
- 血清1:40稀釋 → 加樣→ 37℃孵育1h → 洗板→ 加酶標(biāo)二抗→顯色；
判定值：
- S/P值（樣本OD/陽(yáng)性對(duì)照OD）≥0.5判為陽(yáng)性（間接ELISA）。

四、生物安全與陽(yáng)性處置

實(shí)驗(yàn)室要求：
- ASFV檢測(cè)需在 BSL-3實(shí)驗(yàn)室 進(jìn)行，廢棄物高壓滅菌（121℃×30min）；
陽(yáng)性處置：
- 立即啟動(dòng) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部ASF疫情應(yīng)急預(yù)案，劃定疫點(diǎn)（發(fā)病豬舍）、疫區(qū)（半徑3km）及受威脅區(qū)（半徑10km）；
- 撲殺疫點(diǎn)內(nèi)所有豬只 → 無(wú)害化處理（深埋/焚燒）→ 全面消毒（次氯酸鈉≥2000mg/L）；
監(jiān)測(cè)解除：
- 疫點(diǎn)消毒后空欄42天 → 環(huán)境樣本連續(xù)3次qPCR陰性 → 解除封鎖。

五、國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)與前沿技術(shù)

技術(shù)/標(biāo)準(zhǔn)	核心內(nèi)容	應(yīng)用場(chǎng)景
OIE標(biāo)準(zhǔn)	要求成員國(guó)24小時(shí)內(nèi)上報(bào)疫情，采用qPCR或病毒分離為確診依據(jù)	跨境貿(mào)易、疫情通報(bào)
CRISPR-Cas檢測(cè)	基于Cas12a的側(cè)流層析技術(shù)（1小時(shí)內(nèi)完成），靈敏度達(dá)10 copies/μL	現(xiàn)場(chǎng)快速診斷（無(wú)需PCR儀）
數(shù)字PCR（dPCR）	絕對(duì)定量病毒載量，適合低濃度樣本（如康復(fù)豬排毒監(jiān)測(cè)）	精準(zhǔn)防控、凈化評(píng)估

通過(guò)系統(tǒng)化檢測(cè)與防控，可有效阻斷非洲豬瘟傳播鏈。建議養(yǎng)殖場(chǎng)建立 常態(tài)化監(jiān)測(cè)機(jī)制（每月隨機(jī)抽樣qPCR篩查），并采用 全進(jìn)全出 管理模式降低風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)機(jī)構(gòu)需定期參加 OIE或CNAS能力驗(yàn)證，確保結(jié)果可靠性。對(duì)于疑似病例，務(wù)必遵循 “早、快、嚴(yán)、小” 原則，避免疫情擴(kuò)散。