豬繁殖與呼吸綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測的重要性
豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS）是由PRRS病毒（PRRSV）引起的一種高度傳染性疾病，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。該病毒可通過直接接觸、空氣傳播或垂直傳播感染豬群，導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、弱仔，以及生長豬的呼吸道癥狀。由于PRRSV的高變異性及潛伏期特征，早期快速檢測對疫情控制至關(guān)重要。實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time RT-PCR）技術(shù)憑借其高靈敏度、特異性和快速性，已成為PRRSV診斷的核心方法，廣泛應(yīng)用于臨床檢測、流行病學(xué)調(diào)查及疫苗效果評價(jià)。
檢測項(xiàng)目與樣本類型
本檢測項(xiàng)目主要針對PRRSV的核酸進(jìn)行定性或定量分析，檢測對象包括病毒基因組中的保守區(qū)域（如ORF5、ORF7基因）。適用樣本類型涵蓋：
- 血清或血漿（急性感染期）
- 組織樣本（肺、淋巴結(jié)、扁桃體等）
- 精液（種公豬篩查）
- 環(huán)境拭子（監(jiān)測生物安全）
檢測儀器與設(shè)備
實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測需配備以下核心儀器：
1. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（如ABI 7500、Bio-Rad CFX96）
2. 核酸提取儀（配合磁珠法或柱式法試劑盒）
3. 高速離心機(jī)與微型離心機(jī)
4. 微量分光光度計(jì)（核酸濃度測定）
5. 生物安全柜（樣本前處理）
6. -80℃超低溫冰箱（樣本及試劑保存）
檢測方法關(guān)鍵步驟
檢測流程嚴(yán)格遵循以下步驟：
1. 樣本處理：組織樣本經(jīng)研磨后離心取上清，血清/血漿直接滅活處理。
2. RNA提取：使用TRIzol法或商業(yè)化核酸提取試劑盒提取病毒RNA。
3. 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（部分試劑盒采用一步法RT-PCR）。
4. 熒光PCR擴(kuò)增：
- 設(shè)計(jì)特異性引物與TaqMan探針（靶標(biāo)PRRSV保守區(qū)）
- 反應(yīng)體系包含dNTPs、Taq酶、UNG酶（防污染）
- 設(shè)置擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性→40個(gè)循環(huán)（95℃變性→60℃退火/延伸）
5. 結(jié)果判讀：通過熒光信號閾值（Ct值）判定陽性/陰性，標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量分析。
檢測標(biāo)準(zhǔn)與質(zhì)量控制
本檢測嚴(yán)格參照以下標(biāo)準(zhǔn)：
1. 國家標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 22918-2008《豬繁殖與呼吸綜合征診斷技術(shù)》
2. 國際標(biāo)準(zhǔn)：OIE《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊》第3.8.7章
3. ISO 17025實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系要求
質(zhì)量控制措施包括：
- 每批次檢測設(shè)置陽性對照（PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品）和陰性對照（DEPC水）
- 內(nèi)標(biāo)基因（如β-actin）監(jiān)測RNA提取效率
- 定期參加實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證（如CNAS認(rèn)證比對實(shí)驗(yàn)）
- 采用防污染試劑（如dUTP/UNG酶系統(tǒng)）
結(jié)論與展望
實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)為PRRSV的精準(zhǔn)檢測提供了可靠手段，其檢測限可達(dá)102拷貝/μL，可在感染后3-7天檢出病毒。隨著數(shù)字PCR等新技術(shù)的應(yīng)用，未來檢測靈敏度與標(biāo)準(zhǔn)化水平將進(jìn)一步提升，為PRRS的凈化防控提供更強(qiáng)技術(shù)支撐。
CMA認(rèn)證
檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定證書
證書編號：241520345370
有效期至：2030年4月15日
CNAS認(rèn)可
實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可證書
證書編號：CNAS L22006
有效期至：2030年12月1日
ISO認(rèn)證
質(zhì)量管理體系認(rèn)證證書
證書編號：ISO9001-2024001
有效期至：2027年12月31日
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